甲烷的氢同位素也受其自身成因的制约，生物甲烷的δD分布在−400‰～−150‰。Whiticar认为用δ13C与–δD的关系图解可以区分生物甲烷的形成途径，海相和咸水环境中形成的生物甲烷比淡水环境中的贫13C、富D，在图解中的分界大体为δ13CCH4值为 −60‰ 和δDCH4 值为−250‰。文献报道认为根据天然气的δD和CO2含量可识别两类生物气，乙酸发酵形成的天然气中二氧化碳含量高，甲烷氢同位素很轻；二氧化碳还原形成的天然气中二氧化碳含量低，甲烷的氢同位素偏重。然而，文献新近的实验及现场研究均显示，在贫硫酸盐的淡水环境中形成的甲烷的氢同位素主要受控于孔隙水的δD值，而与甲烷形成路径无关。
产甲烷菌活动残留下许多特殊的生物标记物，其中主要为古细菌起源的类脂生物标记物，包括不规则头对头类异戊二烯和类异戊二烯基丙三醇二醚，如2,6,11,15-四甲基十六烷（Crocetane）、2,6,10,15,19-五甲基二十烷（PMI）、3,7,11,15-四甲基十六醇（植醇）、2,3-二植烷基丙三醇（古细菌醇）及它们的烷基取代物。Thiel等认为2,6,11,15-四甲基十六烷不同于2,6,10,15,19-五甲基二十烷，可能代表特殊的一类古细菌，仅在甲烷厌氧氧化环境中出现。因为在与古气苗有关的沉积物和自生碳酸盐中经常能检测到Crocetane。这些生物标记物在厌氧沉积物和自生碳酸盐沉积中非常富集，分析自生矿物岩石学和类脂物同位素组成能为产甲烷菌活动提供重要证据。与产甲烷菌厌氧环境反向活动即氧化甲烷过程有关的自生碳酸盐矿物及类脂物的碳同位素组成均非常轻，特别是后者可轻达-130.3‰ PDB，比正常的海相类脂物的δ13C值低100‰左右。极轻的同位素反映碳主要来自于细菌参与的生物甲烷氧化过程。大量具有异常轻同位素的自生碳酸盐岩的出现则表明，产甲烷菌活动一旦结束，多数生物甲烷在沉积物埋藏过程中将被消耗而损失。
与生物甲烷伴生的同生地层水如果有较高浓度的溶解无机碳而且其碳同位素值较重，或者甲烷稳定氢同位素和地层水氢同位素具有特定相关关系，均可作为判别产甲烷菌活动的重要标志。
